导读：

近期，郑州大学河南省医药科学研究所的研究团队提出一种高通量制备单分散磁性微球的创新方法，旨在提升His标签蛋白质的纯化效率。作者通过高深宽比多通道微流控芯片技术，克服了传统方法中颗粒大小不一及产量低的缺陷，成功合成了具有高度一致性的PAM-PEG磁性复合微球。利用PEG修饰的四氧化三铁纳米颗粒，该微球不仅表现出卓越的超顺磁性和机械强度，还通过一系列化学修饰实现了高密度的镍离子螯合。

实验结果表明，该新型微球在蛋白质吸附容量和选择性方面均优于市售产品，显著降低了非特异性结合。该成果为生物制药工业提供了一种高性能、可规模化生产的生物分离介质新方案。相关研究以“High-throughput fabrication of monodisperse magnetic PAM-PEG microspheres via high-aspect-ratio droplet microfluidics for efficient and selective his-tagged protein purification”以为题目，发表在期刊《Chemical Engineering Journal Advances》上。

本文要点：

1. 核心挑战与创新背景

• 挑战：传统的蛋白纯化介质（如琼脂糖凝胶）通常存在粒径分布广、机械强度低、磁响应弱等问题；而常规单通道微流控技术虽能保证单分散性，但产量太低，难以实现工业化应用。

• 创新：开发了一种定制的28通道高深宽比（HAR）微流控芯片，结合稳健的物理化学改性策略，实现了高性能分离介质的大规模制备。

2. 微流控芯片设计与高通量制备

• 高效生产：采用28通道并行设计，液滴产生速率达到约170个/分钟/通道，远高于单通道T型芯片的60个/分钟。

• 极佳的均匀性：利用HAR通道对流体的强限制作用，制备出的液滴变异系数（CV）低至98%，保证了高度的单分散性，有助于在色谱柱中形成均匀流场。

3. 复合微球的设计与功能化

• 材质组合：以聚丙烯酰胺（PAM）为基质，通过预交联聚乙二醇（PEG）来增强机械强度和化学稳定性。

• 磁性集成：物理嵌入PEG修饰的Fe₃O₄纳米颗粒，赋予微球超顺磁性（饱和磁化强度达9 emu/g），便于磁分离。

• 表面修饰：经过碱水解、EDC/NHS活化、NTA接枝和Ni²⁺螯合四步化学改性，构建了高密度的镍螯合配体层。

4. 关键性能指标

• 高载镍量：镍装载量达到17 μmol/mL，远超≥15 μmol/mL的国家标准要求。

• 强吸附能力：对模型蛋白（牛血红蛋白BHb）的特定吸附容量约为44-50 mg/mL，比市售产品提高约13%。

• 低非特异性结合：相比商业产品，其非特异性吸附降低了约86%，显著提高了复杂生物基质中目标蛋白的纯度。

5. 实际应用评价

• 蛋白纯化：在大肠杆菌表达系统纯化His标签Protein A的实验中，自制微球表现出极高的选择性，洗脱产物背景更干净，性能优于商业磁珠。

• 工业前景：该研究打通了从实验室合成到大规模制备的路径，且原材料成本低、试剂消耗少，在重组蛋白药物、诊断抗体纯化等领域具有广阔的应用价值。

图1. PDMS微流控芯片的制备：(a) CAD原理图放大视图，显示了不同宽度的通道，依次为5、10、15、20、25和50 μm；(b) 通过软光刻技术制备的硅片模具；(c) 浇铸脱模后的最终PDMS芯片。

图2. 通道横向宽度和纵向深度的光学显微镜图像：(a) 横向宽度：5 μm；(b) 横向宽度：10 μm；(c) 横向宽度：15 μm；(d) 横向宽度：20 μm；(e) 横向宽度：25 μm；(f) 横向宽度：50 μm；(g) 纵向深度：25 μm。

图3. 疏水处理表征：(a) 疏水处理前的接触角；(b) 疏水处理后的接触角；(c) 处理前后的粒径分布。

图4. 高深宽比对微流控装置中液滴产生的影响：(a) 不同通道深宽比下的液滴产生状态；(b) 不同分散相粘度下的液滴产生状态；(c) 不同连续相粘度下的液滴产生状态；(d) 液滴产生过程的显微观察。

图5. 磁性颗粒的表征：(a) Fe₃O₄的红外光谱 (FTIR)；(b) Fe₃O₄-CA的红外光谱 (FTIR)；(c) Fe₃O₄-PEG的红外光谱 (FTIR)；(d) 三种磁性颗粒的X射线衍射 (XRD) 图谱对比；(e) 三种磁性颗粒的振动样品磁强计 (VSM) 曲线对比；(f) 三种磁性颗粒的动态光散射 (DLS) 结果对比。

图6. 磁性微球的形态表征。PAM-PEG@Fe₃O₄-CA微球：(a1) 光学显微镜 (OM) 图像；(a2) 扫描电子显微镜 (SEM) 图像；(a3) 铁 (Fe) 元素的能谱 (EDS) 映射图。PAM-PEG@Fe₃O₄-PEG微球：(b1) 光学显微镜 (OM) 图像；(b2) 扫描电子显微镜 (SEM) 图像；(b3) 铁 (Fe) 元素的能谱 (EDS) 映射图。

图7. 磁性微球的表征分析：(a) PAM-PEG微球的红外光谱 (FTIR)；(b) PAM-PEG@Fe₃O₄-CA微球的红外光谱 (FTIR)；(c) PAM-PEG@Fe₃O₄-PEG微球的红外光谱 (FTIR)；(d) 两种磁性微球的X射线衍射 (XRD) 图谱对比；(e) 两种磁性微球的振动样品磁强计 (VSM) 曲线对比。

图8. PAM-PEG@Fe₃O₄-PEG@NTA-Ni²⁺微球的形态和元素表征：(a) 光学显微镜 (OM) 图像；(b) 带有局部放大插图的扫描电子显微镜 (SEM) 图像；(c) 铁 (Fe) 元素的能谱 (EDS) 映射图；(d) 镍 (Ni) 元素的能谱 (EDS) 映射图。

图9. PAM-PEG@Fe₃O₄-PEG@NTA-Ni²⁺微球的综合表征：(a) 通过激光衍射分析的粒径分布；(b) 热重分析 (TGA) 曲线；(c) X射线衍射 (XRD) 图谱；(d) 振动样品磁强计 (VSM) 滞回线。

图10. PAM-PEG@Fe₃O₄-PEG@NTA-Ni²⁺微球的XPS光谱：(a) 全谱扫描；(b) C1s高分辨率光谱；(c) N1s光谱；(d) O1s光谱；(e) Fe 2p光谱；(f) Ni 2p光谱。

图11. 市售微球的XPS光谱：(a) XPS全谱扫描；(b) C1s光谱；(c) N1s光谱；(d) O1s光谱；(e) Fe2p光谱；(f) Ni2p光谱。

图12. 标准校准曲线：(a) 牛血红蛋白 (BHb)；(b) 牛血清白蛋白 (BSA)。

图13. Protein A的纯化：(a) pET24a(+)-Protein A重组质粒的限制性内切酶图谱；(b1) 使用抗His抗体验证His标签暴露情况的蛋白质印迹 (Western blot) 分析；(b2) 通过直接IgG结合实验进行的Protein A功能验证；(c1) 使用自制PAM-PEG@Fe₃O₄-PEG@NTA-Ni²⁺磁性微球进行纯化效率的SDS-PAGE分析；(c2) 在相同条件下与市售磁珠进行的纯化性能对比。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.ceja.2026.101233

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