导读：

该研究介绍了一个利用液滴微流控技术构建的创新平台，专门用于二硫键富集肽（DRPs）的高通量功能性筛选。研究人员通过改造酿酒酵母，使其在分泌候选肽的同时，在细胞表面表达一种可被蛋白酶切除的报告标签，从而将生化活性直接转化为荧光信号。在皮升级液滴微反应器中，个体细胞被有效隔离以防止交叉干扰，确保了基因型与表型的精准锁定。该系统成功从超过十万个随机变体中筛选出了强效的胰蛋白酶抑制剂，证明了其在大规模库筛选中的卓越性能。与传统仅基于亲和力的筛选方法不同，该平台以生物学功能为导向，为加速多肽药物的发现和进化提供了高效的技术支撑。相关研究以“High-throughput enrichment of functional disulfide-rich peptides by droplet microfluidics”为题目，发表在期刊《Lab on a Chip》上。

本文要点：

1. 研究背景与挑战

• DRPs 的重要性：富含二硫键的肽（DRPs）因其独特的拓扑结构（如胱氨酸结），具有极高的结构稳定性和生物活性，在医药和农业领域有广泛应用。

• 现有筛选技术的局限：传统的筛选技术（如噬菌体展示、酵母表面展示）主要基于“目标结合力”（Affinity），但结合并不一定代表具有生物学功能（如酶抑制活性或受体激动活性）。此外，DRPs 在体外折叠过程中容易形成无活性的异构体。

2. 核心技术平台设计

该平台结合了酵母分泌表达系统与液滴微流控技术，实现了“基因型与表型”的统一：

• 酵母分泌表达：利用酿酒酵母（ cerevisiae）的内质网机器确保 DRPs 能够正确形成二硫键并正确折叠，然后将肽分泌到液滴中。

• 液滴微反应器：将单个酵母细胞封装在皮升（picoliter）大小的油包水液滴中，防止不同变体之间的交叉干扰，使每个液滴成为独立的功能测试实验室。

• 表面报告标签（Reporter Tag）策略：在酵母表面展示一个包含特定蛋白酶切位点的标签。如果酵母分泌的肽具有抑制活性，它就能保护该标签不被液滴中的蛋白酶剪切。被保护的标签随后可通过荧光抗体标记并使用流式细胞分选技术（FACS）进行高效富集。

3. 实验验证：MCoTI-II 库筛选

研究人员以典型的环肽支架 MCoTI-II（一种胰蛋白酶抑制剂）为模型进行了概念验证：

• 库规模：构建了包含 10⁶至 10⁷ 个成员的随机突变库。

• 筛选效果：在针对胰蛋白酶（Trypsin）的筛选中，仅经过 4 轮选择，分选出的阳性细胞比例就从最初的 36% 提升至 98%。

• 测序确认：通过二代测序（NGS）证实，天然的高活性抑制剂序列得到了显著富集。

4. 平台优势与意义

• 功能导向：这是首个能够针对 DRPs 进行直接功能筛选（而非单纯结合筛选）的高通量平台。

• 无标签干扰：由于肽是分泌在液滴内的自由形式，避免了物理系链（如噬菌体外壳蛋白）对肽功能的潜在干扰。

• 高通量与易转化：每天可筛选 10⁵至 10⁶ 个变体，且由于使用的是酵母系统，筛选出的候选药物可直接进入后续的大规模生产流程。

5. 未来展望

该平台具有高度的可扩展性，可以通过更换酵母表面的蛋白酶切位点来筛选针对不同蛋白酶的药物候选物。未来结合 pico-injection（微量注射）等技术，还有望实现更复杂的骨架环化肽库的发现。

在该研究中，选择酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达系统而非传统的噬菌体展示技术，主要基于以下考虑：

• 具备完善的二硫键形成机制：富含二硫键的肽（DRPs）需要复杂的二硫键连接方式来维持其特定的拓扑结构和生物活性。酵母作为真核生物，拥有专门的内质网机器，能够确保二硫键的正确组装和肽段的正确折叠，这对于 DRPs 形成正确的功能构象至关重要。

• 实现“功能导向”而非“结合导向”的筛选：传统的噬菌体展示技术主要用于筛选“目标结合力”（Affinity），即选择在清洗后仍能结合在固定目标上的变体。然而，目标结合并不一定等同于生物学功能（例如，在酶抑制或受体激动实验中，结合力并非最终所需的功能指标）。该平台利用酵母分泌系统，可以在液滴中直接测定肽的功能性生化反应。

• 避免遗传标签的干扰：在噬菌体展示中，肽段通常与巨大的噬菌体外壳蛋白相连，这个遗传标签的体积可能比肽本身大 1000 倍以上，可能会对目标结合产生人为的干扰。而酵母分泌系统能将肽释放到液滴介质中，使变体以无附着的游离形式执行功能，避免了物理系链的影响。

• 易于下游的大规模生产转化：选择酵母作为文库载体的一个重要益处是，筛选出的阳性克隆可以直接进入放大生产流程。相比之下，其他发现技术在从候选药物筛选向商业化生产过渡时，往往面临巨大的挑战。

此外，酵母系统拥有成熟的分子工具用于细胞工程，能够高效地构建 DNA 编码的重组 DRP 文库。虽然噬菌体展示在文库多样性上限上可能更高，但酵母系统在功能富集和生产准备度方面具有显著优势。

图1. 酵母液滴体系用于二硫键富集肽（DRP）文库功能筛选的平台概览。（A）平台工作流程，从文库构建到功能筛选。棕色、橙色和蓝色圆圈代表不同的分泌肽。液滴内部示意结构中的 MCoTI-II 被选作 DRP 测试案例，用于概念验证实验。MCoTI-II 含有半胱氨酸结（cystine knot）结构，这是 DRP 中高度普遍的一种二硫键连接方式。（B）工程化酵母菌株，其表面展示可定制的目标蛋白酶底物以及用于荧光染色的报告 HA 标签。“LYAARLYAV” 被设计为胰蛋白酶切割位点。（C）利用报告标签筛选高效蛋白酶抑制剂的功能筛选原理。anti-HA-PE：PE 偶联的抗 HA 标签抗体。

图2. 酵母分泌表达正确折叠且具有功能活性的 MCoTI-II。（A）线性 MCoTI-II 的酵母分泌表达。表达质粒 pCTMCII 基于 pCTCON2 构建，编码 α-交配因子分泌信号肽（α-MFS）、带有 MCoAEP2 识别基序的 MCoTI-II，以及 HisTag。通过固定化金属亲和层析（IMAC）从培养上清（SN）中富集的分泌线性肽，可经 SDS-PAGE 检测到（W：洗脱前洗涤组分；E：洗脱组分）。（B）MCoAEP2 介导分泌型线性 MCoTI-II 进行头尾环化的示意图。（C）利用 MALDI-TOF-MS 监测线性肽向环状肽的转化率，结果显示于右侧。灰色和棕色圆圈分别标示 MCoTI-II（理论 [M + H]+：3451.56 Da）及 MCoTI-II 前体（理论 [M + H]+：4833.19 Da）的实测质荷峰。（D）S. cerevisiae 产生的 MCoTI-II（灰线）与 CyBase 中已报道的 MCoTI-II 数据41（蓝线）的 Hα 化学位移比较。（E）微孔板检测示意图及含有环状或线性 MCoTI-II 的稀释培养上清的抑制活性计算结果。培养上清以检测缓冲液（100 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.005% Triton-X100，pH 7.4）进行稀释。数据以平均值 ± 标准差表示（n = 3）。

图3. 用于功能筛选的表面展示报告标签。（A）经 anti-HA-PE 染色后的野生型 EBY100（左）与工程化 EBY-PRT（右）酵母细胞的共聚焦显微图像。荧光图像在 561 nm 激发激光条件下获取。比例尺 = 5 μm。（B）离心管内实验示意图。酵母细胞诱导培养 48 h 后分装至 EP 管中，加入蛋白酶处理 15 min，再经 anti-HA-PE 染色并使用 CytoFLEX 流式细胞仪分析。（C）不同浓度丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶和弹性蛋白酶；1、10、50 和 100 nM）处理后酵母细胞的流式细胞分析直方图。（D）在补加蛋白酶培养基中诱导并培养酵母细胞的示意图。诱导后培养 48 h，再以 anti-HA-PE 标记酵母细胞，并通过 CytoFLEX 分析。（E）EBY-PRT（未转化质粒）在无胰蛋白酶培养基（i）、含 0.1 μM 胰蛋白酶培养基（ii）和含 0.2 μM 胰蛋白酶培养基（iii）中的流式细胞散点图；以及转化 pCTMCII 的 EBY-PRT 细胞在无胰蛋白酶培养基（iv）、含 0.1 μM 胰蛋白酶培养基（v）和含 0.2 μM 胰蛋白酶培养基（vi）中的流式细胞散点图。

图4. 液滴内培养及酵母分泌 MCoTI-II 的蛋白酶抑制活性筛选。（A）液滴的明场显微图像。红色箭头指示酵母细胞。比例尺 = 50 μm。（B）在摇瓶与液滴中培养的酵母细胞（转化 pCTMCII 的 EBY-PRT）的流式细胞分析。（C）不同条件下培养的两类酵母细胞的流式细胞分析。图 i、ii、iii 分别为未转化质粒的 EBY-PRT 细胞：在无胰蛋白酶试管培养（i）、含 0.1 μM 胰蛋白酶试管培养（ii）以及含 0.1 μM 胰蛋白酶液滴培养（iii）。图 iv、v、vi 分别为转化 pCTMCII（仅编码单一肽）的 EBY-PRT 细胞：在无胰蛋白酶试管培养（iv）、含 0.1 μM 胰蛋白酶试管培养（v）以及含 0.1 μM 胰蛋白酶液滴培养（vi）。细胞在流式分析前均以 anti-HA-PE 染色。

图5. 针对丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶）的 MCoTI-II 文库筛选。（A）胰蛋白酶与 MCoTI-II 复合物结构（PDB 4GUX）、天然 MCoTI-II 线性肽序列，以及 loop 1 与 loop 6 中发生序列变异的区域。（B）文库筛选流程示意图。1）将编码 MCoTI-II 变体的 DNA 文库与质粒骨架转化入 EBY-PRT；2）将转化后的酵母细胞封装进液滴；3）在液滴内进行肽变体表达及其功能反应；4）从液滴中释放酵母细胞，并以 anti-HA-PE 标记；通过 FACS 收集 PE 阳性细胞；5）对分选获得的细胞进行恢复培养、下一代测序文库制备，并用于下一轮筛选富集。（C）MCoTI-II 文库针对胰蛋白酶进行四轮筛选的流式细胞数据。灰色点表示未染色细胞，蓝色点表示在不含胰蛋白酶培养基中培养得到的 PE 阳性细胞，红色点表示实验样本。每轮筛选获得的细胞比例标注于图中。（D）每轮针对胰蛋白酶筛选后丰度最高的五条肽序列。天然 MCoTI-II 序列以粉色高亮显示。“+” 表示终止密码子。

论文链接：https://doi.org/10.1039/D5LC00261C

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