导读：

近期，中国农业大学林建涵教授团队成功开发了一种基于壳聚糖修饰的PDMS核酸纯化通道和RAA-T7-CRISPR/Cas13a核酸定量系统的新型离心微流控平台，用于食源性病原体的快速检测。相关研究以“A centrifugal microfluidic platform for rapid detection of pathogens based on chitosan nucleic acid extraction and RAA-T7-CRISPR/Cas13a nucleic acid detection”为题目发表于期刊《Sensors and Actuators B: Chemical》。

本文要点：

1、本研究开发了一种新型细菌检测平台，利用壳聚糖进行核酸提取、RAA-T7-CRISPR/Cas13a系统进行核酸定量，并结合离心微流控芯片实现全自动操作。

2、通过壳聚糖静电吸附捕获细菌样品中的核酸，然后经乙酸钠缓冲液洗涤和Tris-HCl缓冲液洗脱，最终在RAA-T7-CRISPR/Cas13a系统中等温扩增并实时检测产生的荧光信号。

3、该离心微流控芯片设计精巧，包括壳聚糖修饰通道、八个功能腔室和三个虹吸阀，实现了核酸的自动捕获、洗涤、洗脱、扩增和检测。

4、该平台可在1小时内自动检测沙门氏菌，在最佳使用条件下，该平台对鸡上清液的检测限为10CFU/mL，平均回收率为106.9%，标准差为6.4%。

5、这一创新平台具有扩展至多目标检测的潜力，通过利用不同的RAA引物和crRNA，可适用于多种目标的同时检测，从而提高其在各种环境中的通用性和实用性。

全文总结/概括：

该细菌检测平台的关键组成部分包括：

1、离心微流控芯片：

• 设计有壳聚糖修饰的PDMS通道、8个功能腔室和3个虹吸阀。

• 实现了核酸捕获、洗涤、洗脱、扩增和检测等自动化样品处理。

2、基于壳聚糖的核酸纯化：

• 通过GPTMS介导将壳聚糖共价固定在PDMS表面。

• 利用静电吸附作用从细菌样品中高效捕获和纯化核酸。

3、RAA-T7-CRISPR/Cas13a核酸检测：

• 结合了重组酶辅助扩增（RAA）、T7体外转录和CRISPR/Cas13a系统。

• 实现了等温扩增和实时荧光检测目标细菌DNA。

使用CRISPR/Cas13a系统进行核酸检测具有以下优势：

1、高灵敏度：

• CRISPR/Cas13a系统可以检测到aM水平的核酸，具有极高的灵敏度。

• 这使得该平台能够检测到极低浓度的细菌样品。

2、高特异性：

• 通过设计特异性的crRNA序列，CRISPR/Cas13a系统能够精确识别目标核酸序列。

• 这确保了该平台对目标细菌具有很高的特异性，不会受到其他细菌的干扰。

3、等温检测：

• CRISPR/Cas13a系统可以在37℃下进行等温扩增和检测，无需复杂的温控设备。

• 这简化了检测流程，有利于实现现场快速检测。

4、自动化：

• 将CRISPR/Cas13a系统集成到离心微流控芯片上，实现了全自动的核酸检测。

• 大大提高了检测效率，降低了人工操作错误的风险。

综上所述，CRISPR/Cas13a系统的高灵敏度、高特异性、等温性和可自动化等特点，使其非常适合与该离心微流控平台集成，以实现快速、灵敏和自动的细菌检测。

图1.该细菌检测平台的工作原理。

图2.离心式微流控芯片的设计和工作流程。

图3.微流控芯片的表面修饰。

图4.基于壳聚糖的PDMS表面修饰用于核酸纯化：（A）壳聚糖修饰PDMS表面的原理。（B）荧光胺量子点修饰的验证。（C）基于壳聚糖的核酸纯化效果验证（N=3）。（D）基于壳聚糖的核酸纯化随时间的稳定性验证（N=3）。

图5.RAA-T7-CRISPR/Cas13a的原理及优化。

图6.（A）该离心平台的校准曲线（N=3）；（B）该离心平台的特异性（N=3）。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2023.134223