背景：
自2019年12月以来，由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的急性呼吸道疾病COVID-19在全球范围内导致了数百万的感染和死亡。这场大流行暴露了人类在应对新兴传染病方面的准备不足，特别是缺乏快速、准确、资源独立、即用型的现场诊断技术。如果具备这样的技术，感染者可以迅速被识别和隔离，从而打破感染链，减少对社会和经济的影响。尽管COVID-19大流行似乎已经结束，但为了应对未来不可避免的大规模新病原体感染，迫切需要一种便携、经济且实用的现场诊断设备。
导读：
近期，山东大学王明钰教授、陶继方教授、李玲等人开发了一种基于冻干逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术的便携式微流控核酸检测设备，集成核酸提取、扩增和荧光检测功能，具备快速、经济、灵敏、即用型的特点，适用于资源有限地区的现场病原体诊断。相关研究以“Development of a portable multi-step microfluidic device for point-of-care nucleic acid diagnostics”为题目，发表在期刊《Analytica Chimica Acta》上。
本文要点：
1、本研究开发了一种基于冻干逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）试剂的设备，实现了快速核酸诊断。优化后的自制RT-LAMP试剂消除了非特异性扩增。
2、该多步骤设备集成了核酸提取、RT-LAMP和荧光检测，能够实现样本进、结果出的全自动诊断。
3、该设备在检测SARS-CoV-2和阴道毛滴虫RNA样本方面显示出高灵敏度，45分钟内的检测限（LOD）分别为400拷贝/μL和80拷贝/μL。培养的阴道毛滴虫样本的检测限为0.32 cells/μL，检测时间为50分钟。
4、此外，冻干的自制RT-LAMP试剂在4°C下可保存长达30天，且保持高灵敏度和检测能力。每次检测成本低至0.45美元。
5、通过整合冻干自制RT-LAMP试剂和微流控芯片，该设备实现了即用型、无需实验室、快速且经济的核酸检测，为复杂设备提供了可行的替代方案，特别适用于资源有限地区的现场检测。
在该诊断设备中使用微流控芯片的优势包括：
1、高集成度：微流控芯片能够将多个步骤（如样本裂解、核酸提取、RT-LAMP反应和荧光检测）集成在一个小型设备中，简化了操作流程。
2、减少交叉污染：芯片设计可以防止操作人员与试剂直接接触，从而降低交叉污染的风险，提升检测的准确性。
3、快速反应时间：微流控技术能够加快反应速度，提高检测效率，缩短结果获取时间。
4、低试剂消耗：微流控芯片使用的试剂量较少，降低了检测成本。
5、便携性：该设备小巧轻便，适合在资源有限的环境中使用，便于现场检测。
6、自动化和易操作性：微流控芯片的设计使得设备操作更加简单，减少了对专业实验室和训练有素人员的依赖。
7、提高灵敏度：通过优化反应条件和提高热交换效率，微流控芯片能够实现更高的检测灵敏度。
总之，微流控芯片的使用使得该诊断设备在便携性、成本效益和操作简便性等方面具有显著优势，适合用于现场快速检测。
随着新兴病原体的不断出现，如何优化现有的RT-LAMP系统以适应不同的病毒或细菌？
1、引物设计：针对不同病原体的特定基因，使用LAMP引物设计软件（如Primer Explorer V5）设计合适的引物。确保引物能够特异性地识别目标病原体的核酸序列。
2、反应条件优化：不同病原体可能对反应条件（如温度、pH值和离子浓度）有不同的要求。通过实验确定最佳的反应条件，以提高反应效率和特异性。
3、酶的选择：根据目标病原体的特性，选择合适的DNA聚合酶和逆转录酶。例如，使用具有高温稳定性的酶可以提高反应的可靠性。
4、样本处理：优化样本提取和处理流程，以确保从复杂样本中有效提取目标病原体的核酸。可以考虑使用磁珠等方法进行核酸的分离和纯化。
5、多重检测能力：考虑开发多重LAMP反应系统，能够同时检测多种病原体。这可以通过在同一反应中使用不同的引物组合来实现。
6、数据分析和结果解读：结合先进的数据分析技术（如机器学习）来提高检测结果的准确性和可靠性。
通过这些优化措施，该便携式微流控设备可以有效地扩展到其他病原体的检测，满足不同临床需求。
图1.微流控芯片的设计和诊断工作流程。
图2.PoCT装置的设计。
图3.热板的热分布和响应。
图4.使用StepOne Plus实时PCR系统测试优化的反应系统。
图5.使用PoCT装置检测S基因的敏感性和特异性。
图6.PoCT装置对阴道毛滴虫肌动蛋白基因的敏感性。
图7.冻干反应体系的稳定性。
论文链接：https://doi.org/10.1016/j.aca.2024.343518
