文献导读：
近日，大连理工大学贾凌云教授团队联合大连大学附属中山医院研究人员提出了一种利用微流体液滴技术制造海藻酸钠-Matrigel (AM) 复合水凝胶微球的新方法，旨在为肿瘤类器官提供更真实的生长环境。研究人员开发了一种创新的外部凝胶化策略，通过在预置钙离子的疏水性明胶底物上接收液滴，成功克服了传统方法中酸性环境导致的细胞毒性及微球形状不规则的问题。这种复合微球具有可调节的机械强度，其刚度比纯 Matrigel 提高了 7 倍以上，能够更好地模拟原生肿瘤的微环境。
实验证明，在该系统中培养的肿瘤类器官表现出更强的耐药性，更符合临床实际情况。整套工艺实现了从液滴形成、精准分配到原位培养的集成化流程，显著提升了高通量药物筛选的效率和准确性。该技术为个性化医疗和精准抗癌药物测试提供了一个高效且具有生物相容性的新型实验平台。相关研究以“Droplet microfluidic fabrication of stiffness-tunable alginate-Matrigel microspheres with innovative external gelation for high-throughput tumor organoid assays”为题目，发表在期刊《Biofabrication》上。
本文要点：
1. 研究背景与挑战
Matrigel的局限性：虽然Matrigel是类器官培养的常用基质，但其硬度较低，无法模拟真实肿瘤微环境的高硬度特性，而基质硬度对癌细胞的增殖、侵入和耐药性有重要影响。
微流控技术的瓶颈：传统的微流控海藻酸钠凝胶化方法通常采用酸触发的内部凝胶化，其酸性环境会损伤细胞活性；而现有的外部凝胶化方法常导致微球形状不规则（如葫芦形或哑铃形）。
2. 技术创新：新型外部凝胶化策略
材料组合：开发了海藻酸钠-Matrigel（AM）互穿聚合物网络，结合了Matrigel的生物活性和海藻酸钠的机械性能调节能力。
创新凝胶化方法：设计了一种预载钙离子的疏水性明胶底物（接触角 > 80°）接收液滴。
优势：液滴在疏水底物上能保持完美的球形；钙离子由下向上扩散实现原位快速交联，避免了酸毒性。
固着机制：海藻酸钠分子与底物中的钙离子在界面处形成薄且稳固的互穿网络，使微球能“锚定”在孔板底部，便于后续换液操作。
3. 系统集成与高通量特性
一体化工作流：将液滴生成、空间分配、凝胶化、培养和药物检测集成在一个简化的单步过程中。
高效率：使用自动化分配仪器，约8分钟即可完成一个384孔板的微球阵列制备，且微球尺寸一致性高（变异系数 CV < 2%）。
4. 实验结果与性能验证
机械硬度可调：微球硬度可从纯Matrigel的6 kPa提升至AM微球的5.0 kPa（提升超过7倍），更接近真实的肺癌组织硬度（~4 kPa）。
优异的生物相容性：外部凝胶化法制备的微球细胞存活率高达96%，显著优于内部凝胶化法的73%。
病理特征保持：患者来源的类器官（PDOs）在微球中维持了三维结构，并保留了原始肿瘤的病理标志物（如TTF-1、Ki67、CK7等）。
5. 药敏检测发现
硬度诱导耐药：相比于软基质（纯Matrigel），在硬度更高的AM微球中，A549细胞和患者来源类器官对紫杉醇和吉西他滨的耐药性增强（IC50值显著升高）。
检测灵敏度：微球微培养模式比传统的本体（Bulk）培养更能敏感地反映药物反应差异。
总结：该研究提供了一个简单、生物相容性好且可重复的平台，通过模拟肿瘤微环境的物理特性，为类器官建模、药物筛选和临床个体化用药评价提供了强有力的工具。
图1. 用于药物筛选的肿瘤类器官阵列制备过程。（a）AM液滴阵列生成和药物筛选的方案图。（b）T型同轴流体装置的图像。（c）浸没在己烷中的明胶底物上的AM液滴（左）、凝胶化5分钟并去除油相后（中）、DMEM中的AM微球（右）。（d）球在明胶底物上的锚定机制。（e）在明胶底物上制备的包裹A549细胞的AM微球活/死染色图像（绿色：Calcein-AM，活细胞；红色：PI，死细胞）。（f）通过内部凝胶化方法（在溶有1 μL/mL乙酸的油中凝胶化5分钟）制备的包裹A549细胞的AM微球。（g）通过外部凝胶化和内部凝胶化方法制备的微球中的细胞活性（n=5）。比例尺=100 μm。
图2. 底物成分对微球形貌的影响。AM微球在不同浓度的（a）琼脂糖、（b）明胶、（c）低替代率GelMA（GelMA-Low）和（d）高替代率GelMA（GelMA-High）底物上的情况（底物浓度单位：mg/mL），接触角（中间行），以及凝胶化后培养基中微球的CLSM（共聚焦显微镜）图像（底部行）。（e, f）明胶、GelMA-Low和GelMA-High底物的动态接触角（n=8）。比例尺=100 μm。*p<0.05，**p<0.01，ns：无显著性差异。
图3. 不同明胶水凝胶底物上具有代表性的AM微球形貌。在具有（a）不同氯化钙浓度（单位：mg/mL）的明胶底物上的AM微球形貌（中间行图像为微球在水中的CLSM图像，底部行图像为FITC标记的海藻酸钠在微球赤道横截面的分布情况）。比例尺=100 μm。（b）在具有不同钙浓度的明胶底物上制备的AM微球的球形度（n≥8）。在（c）干燥和（d）潮湿条件下制备的明胶底物上生成的AM微球代表性图像，以及（e）对应的球形度定量分析（n≥8）。使用（f）硅油和（g）十一烷油制备的AM微球代表性图像，以及（h）对应的球形度定量分析（n≥8）。比例尺=100 μm。（i）经过工艺优化后制备的AM微球图像。比例尺=300 μm。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns：无显著性差异。
图4. 不同工艺条件对所制备微球尺寸的影响。通过改变以下参数制备的AM微球：（a）油相流速、（b）水相流速、（c）油相运动粘度、（d）出口管内径、（e）针头尺寸和出口管内径、（f）海藻酸钠浓度、（g）CaCl2浓度，以及（h）海藻酸钠的G/M单元比例。（i）在相同加工参数下不同批次间的微球尺寸变化。所有批次的直径均无显著差异（p>0.05）。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns：无显著性差异。比例尺=100 μm。测试的基本参数：n≥10，出口管内径=0.3 mm，针头尺寸=32 G，水相流速=1 μL/min，油相流速=100 μL/min，交联时间=10 min，G/M比例=中等，Matrigel体积=50%（v/v），海藻酸钠浓度=10 mg/mL，CaCl2浓度=1 mg/mL。
图5. 高通量样品分配工艺优化。（a）在不同油/水流速下制备的AM微球平均直径（n≥50）。（b）不同油/水相流速下1分钟内的液滴生成数量。***p<0.001。（c）三种不同水/油流速比下制备的AM微球直径分布。（d, e, f）三个384孔板中的微球分布情况。蓝色孔表示含有微球，红色孔表示空孔。（g）每种流速比条件下384孔板中的空孔数量。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图6. 生物相容性和机械性能表征。（a）油相流速对细胞活性的影响（n=3）。（b）Matrigel、0 AM、0.50 AM、0.75 AM和1.0 AM微球的杨氏模量及（c）代表性压痕-载荷曲线（n≥8）。（d）微球内细胞数量的分布和变异系数（n=50）。在第2天和第6天，于0.50 AM和1.0 AM微球中生成的（e）A549球体和（f）P178类器官的代表性光学和活/死染色图像（绿色：活细胞；红色：死细胞）。在0.5 AM和1.0 AM中培养不同天数的（g）A549球体和（h）P178类器官的细胞活性和增殖测试（n=3）。在第2天和第6天，于Matrigel（M）和0AM微球中生成的（i）A549球体和（j）P178类器官的代表性光学和活/死染色图像。（k）A549球体和（l）P178类器官在Matrigel和0AM微球中培养的细胞活性和增殖测试（n=3）。在含有0、0.50和1.0 mg/mL钙浓度的钙模块中培养不同天数的（m）A549球体和（n）P178类器官微球的增殖率（n=3）。比例尺=100 μm。（O）来自肺癌患者的P178类器官培养。微球（Droplet, 0 AM）和常规（Bulk）培养，以及来源肿瘤组织中肺癌相关标记物的染色。比例尺=50 μm。*p<0.05，***p<0.001，ns：无显著性差异。
图7. A549球体使用（a, b）紫杉醇和（c, d）吉西他滨进行药物评估的结果，以及P178类器官使用（e, f）紫杉醇和（g, h）吉西他滨进行药物评估的结果（n=3）。（i）A549球体使用紫杉醇和吉西他滨进行药物评估的结果（n=3；A549被包封于含钙模块中的Matrigel微球内，钙浓度分别为0、0.5和1 mg/mL）。
论文链接：https://doi.org/10.1088/1758-5090/ae7209
(本文仅供参考学习及传递微流控研究成果，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除)
