研究背景

临界尺寸大块骨缺损的修复是再生医学领域的重大难题。模拟天然骨折愈合中软骨内成骨（Endochondral Ossification）过程的骨痂类器官（Callus Organoids）为大块骨修复开辟了新途径。然而，传统基于天然胶原/Matrigel构建的类器官面临功能性血管网络缺失与力学微环境匹配度低的瓶颈，易导致中心细胞缺氧坏死；同时人工滴制生产效率低且批间差异大。因此，构建兼具微环境精准调控与高通量均一制备能力的血管化骨痂类器官，是实现高效骨再生的关键。

近日，中国科学院上海硅酸盐研究所吴成铁研究员、马红石副研究员团队，联合中国科学院大学及中国科学院苏州生物医学工程技术研究所研究人员，开发了一种基于液滴微流控技术与无机硅酸盐生物材料刺激的血管化骨痂类器官构建平台。研究通过精细调控硅酸镁纳米颗粒的拓扑形貌以优化水凝胶力学微环境，有效激活了FAK-YAP等机械力传导通路，实现了软骨内成骨分化与内皮网络组装的强效协同。在大鼠临界尺寸骨缺损模型中，该血管化骨痂类器官在植入6周后显著促进了骨再生与缺损核心区域的功能性血管生成。相关研究以“Silicate Biomaterials-Stimulated Vascularized Callus Organoids for Bone Tissue Regeneration”为题发表于期刊《Advanced Materials》。

主要内容

针对传统人工滴制类器官尺寸不一及中央细胞易坏死的问题，研究团队首先设计并制备了液滴微流控芯片，实现了硅酸盐复合水凝胶微球的高通量、高度均一化生产。考虑到氧气在组织中的有效扩散极限约为200 μm，且200–300 μm是细胞自组织形成三维结构的最佳空间尺度，团队通过精确调控微流控芯片中水相（4 μL/min）与油相（11 μL/min）的剪切流速，将微球粒径精准控制在约250 μm。同时，团队合成了零维纳米球（NS）、一维纳米管（NT，长径比~10）和三维不规则颗粒（IR）三种不同几何形貌的硅酸镁纳米颗粒，并将其引入 GelMA 水凝胶网络中，为后续血管化骨痂类器官的自组织发育建立了兼具生物活性离子释放与微观拓扑结构的物理化学微环境（图1）。

图1 液滴微流控芯片高通量制备硅酸盐生物陶瓷工程化水凝胶及刺激血管化骨痂类器官促进骨再生的示意图

在材料体系的微观表征与制备工艺优化中，扫描电镜（SEM）、能谱（EDS）及 X 射线衍射（XRD）分析证实了三种形态硅酸镁纳米颗粒的成功合成与元素均匀分布。在微流控包裹过程中，复合水凝胶微球展现出极其窄的粒径分布（主要集中于240–260 μm）以及稳定的多孔微观结构，这种内部互通的多孔拓扑网络极大地促进了类器官发育过程中养分、代谢产物与生物活性因子的交换与传输（图2）。

图2 不同形貌硅酸镁纳米颗粒表征、微流控芯片结构及复合水凝胶微球的制备与微观形态

为了探究纳米颗粒几何形貌对复合水凝胶宏观力学与内部应力分布的调控规律，团队开展了力学测试与有限元模拟（FEA）。压缩与流变测试表明，掺杂一维纳米管的复合水凝胶（2NT-GM）展现出最高的压缩模量与储能模量（G'）。有限元模拟进一步揭示，在单轴压缩与流体静压条件下，高长径比的硅酸镁纳米管能够在聚合物网络中建立贯穿性的应力传递网络，形成高度均匀且强烈的应力场；相比之下，纳米球与不规则颗粒仅能引发局部的应力集中。这种广域均匀分布的力学微环境，为类器官内部细胞协同感知力学刺激并进行跨尺度信号传导提供了理想的物理生态位（图3）。

图3 形貌依赖性硅酸镁对复合水凝胶力学性能的调控及有限元应力分布模拟

在评估硅酸盐生物材料对骨痂类器官体外软骨内成骨分化的影响时，团队筛选出 2 wt.% 为硅酸镁的最佳掺杂浓度（2NS-GM）。实验表明，该浓度不仅维持了90%以上的高细胞存活率，更显著促进了早期成软骨标志物 Sox9、Aggrecan 和 Col2a1 的表达；至培养第14天，代表软骨基质重塑与肥大的 MMP-13 和 Col10a1 表达显著上调，标志着软骨向骨转变的启动。同时，成骨相关基因（OPN、BMP2、RUNX2）及血管生成基因（VEGF）表达被显著激活，证明硅酸镁释放的 Mg²⁺ 与硅酸根离子能够协同驱动骨痂类器官的时空有序发育（图4）。

图4 硅酸镁复合水凝胶调控骨痂类器官软骨内成骨过程中的成软骨与成骨分化

内皮网络的高效组装是骨痂类器官实现功能化修复的核心。研究发现，在培养第7天，2NT-GM 组类器官内部形成了最为成熟且连续的 CD31⁺ / PDGFRβ⁺ 血管网络，荧光面积相比对照组提升约 2.3 倍。基因表达检测显示，促血管生成核心趋化因子 CXCL12（上调 3.1 倍）与低氧诱导因子 HIF-1α（上调 2.7 倍）显著激活。这一结果证实一维纳米管的拓扑结构模拟了细胞外基质的纤维导向，为内皮细胞的定向迁移与管腔组装提供了最佳物理诱导信号（图5）。

图5 形貌依赖性硅酸镁水凝胶促进骨痂类器官内内皮网络组装与血管生成

针对材料调控类器官发育的分子机制，研究团队系统解析了力学微环境引发的机械力信号传导通路。2NT-GM 组高基质刚度与高效应力传递显著增强了整合素聚簇（Integrin clustering）与黏着斑激酶（FAK）的磷酸化，诱导细胞内部组装出密集的 Actin/Myosin 应力纤维，进而强效驱动机械力转录核心因子 YAP 的核转移。入核的 YAP 与 TEAD 结合，直接转录激活 RUNX2、OPN 和 BMP2 等成骨基因，阐明了无机硅酸盐纳米管通过物理力学刺激驱动骨痂类器官成熟的分化机制（图6）。

图6 硅酸镁引发的微观力学微环境与骨痂类器官 YAP 力学响应信号机制

组织学染色与转录组学（RNA-seq）分析进一步验证了类器官内部矿化基质的沉积与分子全景。2NT-GM 组类器官展现出极其致密的胶原纤维网络（Masson/Sirius Red）与酸性蛋白聚糖沉积（Safranin O/Alcian Blue）。RNA 测序筛选出 1,119 个 2NT-GM 特异性差异基因，KEGG 与 GOPathway 富集分析表明，“ECM-受体相互作用”、“钙信号通路”、“粘附斑”以及“PI3K-Akt 信号通路”发生显著富集，从全转录组维度揭示了硅酸盐纳米管通过优化基质构建与力学感知促进软骨内成骨的分子网络（图7）。

图7 骨痂类器官矿化基质沉积表征及 RNA-seq 转录组特定分子机制解析

在大鼠股骨髁临界尺寸骨缺损（直径 3.5 mm，深度 3.5 mm）的体内修复评价中，植入 2NT-GM 调控的血管化骨痂类器官（BOs/2NT-GM）6 周后，Micro-CT 三维重构显示缺损区域几乎被新生骨组织完全填满，实现了与周围天然骨的无缝桥接与整合。定量分析表明，其骨体积分数（BV/TV）与骨表面积/总体积（BS/TV）显著优于未处理组与纯水凝胶组。组织学切片（H&E、Masson、Safranin O）证实缺损区形成了成熟且排列整齐的骨小梁结构，且软骨模板已被成熟骨基质顺畅替换（图8）。

图8 血管化骨痂类器官促进大鼠股骨髁缺损修复的体内 Micro-CT 及组织学评价

体内免疫组化与荧光评估进一步证实，BOs/2NT-GM 组在骨缺损核心区域诱导生成了大量 CD31⁺ 与 eNOS⁺ 阳性的功能性微血管，彻底解决了大块缺损中心缺血坏死的难题。同时，成熟成骨标志物骨钙素（OCN）与 I 型胶原（COL1）大量表达，且 Vinculin 与 YAP 蛋白信号持续维持高水平，表明类器官在体内高效响应了局部生物力学刺激，实现了血管化与成骨重塑的高度协同（图9）。

图9 体内骨缺损处血管生成、骨基质沉积及力学感知蛋白表达评估

总结与展望

本研究成功构建了一种由无机硅酸盐生物材料驱动的血管化骨痂类器官高通量制造与再生平台。研究创新性地将液滴微流控技术与形貌可控的硅酸镁纳米管相结合，克服了传统类器官尺寸不可控与缺少功能血管网络的瓶颈，揭示了纳米管拓扑结构通过改善水凝胶整体与局部的力学微环境，激活 FAK-YAP 及 PI3K-Akt 信号通路驱动软骨内成骨与血管发育的分子机制。在大鼠临界尺寸骨缺损模型中，该血管化骨痂类器官展现出强效的成骨与成血管协同修复能力。尽管本研究在细胞来源上（体外人源细胞模型与体内大鼠细胞模型）存在一定跨度，未来仍需在免疫缺陷或人源化骨缺损动物模型中进一步验证其长期安全性与临床转化可行性，但该模块化工程策略为大块骨缺损的高效生理性再生提供了极具前景的新思路。

论文链接：https://doi.org/10.1002/adma.75339

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