水凝胶微球作为功能性三维（3D）细胞载体在细胞附着和生长方面备受关注，具有细胞治疗和生物医学研究的潜力。脱细胞外基质（dECM）衍生的水凝胶保留了天然组织的物理和生物特性，具有高生物活性和组织特异性，可促进组织再生。
近期，中山大学全大萍教授、白莹副教授团队开发了一种二级温控微流控系统，用于高效制备无化学交联的dECM水凝胶微球，这些微球具有高生物活性和组织特异性，可用于3D细胞培养、细胞移植及再生医学研究。相关研究以“Bioactive Decellularized Extracellular Matrix Hydrogel Microspheres Fabricated Using a Temperature-Controlling Microfluidic System”为题目，发表在期刊《ACS Biomaterials Science & Engineering》上。
本文要点：
1、本研究开发了一种新型二级温控微流控系统，可高效制备原始dECM水凝胶微球。
2、以猪脱细胞外周神经基质（pDNM）为模型材料，无需额外支撑材料或化学交联即可生成稳定的pDNM微球（pDNM-MSs），通过调节水/油相流速比实现精确的尺寸控制。
3、pDNM-MSs在14天内保持球形和纳米纤维超微结构，且支持雪旺细胞、PC12细胞和神经干/祖细胞的附着、生长和增殖，表现出优于市售明胶微球的性能。
4、该dECM水凝胶微球为3D细胞培养和功能化提供了高生物活性微环境，具有广泛的生物医学应用前景。
温控微流控系统（TSTC-MS）利用dECM溶胶的温度敏感性（溶胶-凝胶转变特性），在低温下形成乳液，在高温下完成凝胶化，从而实现了无需化学交联剂的dECM水凝胶微球的高效制备。具体步骤如下：
1、系统组成：TSTC-MS由PDMS微流控芯片、两个注射泵、一个加热磁力搅拌器、两根聚四氟乙烯管（内径1.0 mm）和一根硅胶管（内径2.0 mm）组成。
2、水油相混合：水相主要由dECM溶胶（pDNM-sol）组成，油相为含有20%（v/v）Span 80的矿物油。在0～4℃的环境温度下，水相和油相在微流控芯片内混合形成乳液。
3、乳液形成与凝胶化：乳液从微流控芯片的出口流入连接的硅胶管，硅胶管浸没在37℃的水浴中。在37℃的温度下，dECM溶胶发生凝胶化，形成水凝胶微球。
4、去除残余油相：凝胶化后的微球被转移到双层液体浴中（由相分离的乙醚和PBS溶液组成）。通过二乙醚去除残余的矿物油，随后将微球浸泡在PBS溶液中。
5、微球收集与清洗：通过离心（2000 rpm）收集微球沉淀，并用PBS溶液清洗三次以去除残留杂质。
6、尺寸调控：通过调节水相和油相的流速比（例如水相流速为66.7、100、200 μL/h，油相流速为1000、1500、3000、5000、7000 μL/h），可以精确控制微球的尺寸分布。
使用脱细胞外基质（dECM）水凝胶微球进行细胞培养具有以下优势：
1、高生物活性：dECM保留了天然组织中的功能性分子和纳米纤维超微结构，可促进细胞粘附、延展和增殖以及组织特异性功能（如细胞迁移和定向分化），提供接近天然组织的生理微环境。
2、组织特异性：dECM来源于特定组织，具有与原始组织相关的生物学特性，能够更好地支持目标组织的再生和功能恢复。
3、三维微环境：dECM水凝胶微球提供了三维（3D）培养环境，增强了细胞与基质的相互作用，有利于氧气、营养物质和代谢废物的交换，从而维持细胞活力。
4、无化学交联剂：通过温控微流控系统制备的dECM水凝胶微球无需化学交联剂，避免了化学处理对细胞活性的潜在影响，同时保持了较高的孔隙率和生物相容性。
5、尺寸可控性：微流控技术可精确调控微球尺寸，适应不同细胞类型的培养需求。
6、多功能性：dECM水凝胶微球可作为细胞载体，用于细胞移植、药物释放和组织再生等多种生物医学应用。
综上，dECM水凝胶微球为细胞培养提供了高度仿生的微环境，具有广泛的应用潜力。
图1.使用二级TSTC-MS制备pDNM水凝胶微球。
图2.分散在矿物油中的pDNM-MSs的制备和粒径分布。
图3.pDNM水凝胶微球的微观表征。
图4.pDNM-MSs中负载的FITC-葡聚糖的持续释放。
图5.pDNM-MSs在PBS溶液中的降解和形态变化。
图6.通过荧光共聚焦显微镜对分别在明胶-MSs和pDNM-MSs上培养（A）1天和（B）3天的原代SCs进行免疫荧光染色。SCs用S100（绿色）标记。细胞骨架用鬼笔环肽（红色）标记，细胞核用DAPI（蓝色）标记。（C）明胶-MSs和pDNM-MSs上的SC纵横比。ns，p>0.05，****p<0.0001，n>30。
图7.在pDNM-MSs上3D培养的NSPCs的免疫荧光染色。
论文链接：https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials.1c01474
