重金属因其毒性和不可生物降解性而对人类生命构成严重威胁。生物修复是一种通过自然生物过程去除有害物质的有效绿色策略。然而，微生物的应用在很大程度上受到限制，因为浮游微生物难以抵抗恶劣环境，并且在自然界中很难回收。

近期，山东第一医科大学魏云云、韩子强、毛小龙等人开发了一种利用液滴微流控技术制备的活性益生菌Janus微粒，可有效去除废水中的铜离子（Cu²⁺），提供了一种绿色可持续的生物修复策略。相关研究以“Bioremediation of heavy metal ion (Cu2+) by live probiotic Janus microparticles using droplet-based microfluidic technique”为题目，发表在期刊《Chemical Engineering Journal》上。

本文要点：

1、本研究采用液滴微流控和光交联技术制备了具有磁性的活性益生菌Janus微粒。

2、布拉氏酵母菌（S. boulardii）和Fe₃O₄纳米粒子分别被包裹在Janus微粒的两个半球中，封装的S. boulardii在第10天和第15天的存活率均超过90%，且未从水凝胶中释放。

3、这种活性益生菌Janus微粒可以有效去除废水中的铜离子（Cu²⁺），7天后Cu²⁺的去除率达到64.78%。微粒中布拉氏链球菌的吸附能力达到51.83mg/g。

4、暴露于Cu²⁺ 5天后，包封的布拉氏链球菌的细胞活力是游离布拉氏链球菌的5倍。

5、RNA测序和western blotting结果表明，布拉氏链球菌Janus微粒对Cu²⁺的去除主要依赖于铜/锌超氧化物歧化酶介导的生物转化过程。

在这项研究中，Janus微粒由两个不同的半球组成，每个半球都有特定的功能：

• 聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）半球：这个半球提供了一个物理屏障，用于封装活性益生菌 boulardii。PEGDA是一种水凝胶材料，能够保护封装在内的S. boulardii免受外界恶劣环境的影响，并且防止S. boulardii从微粒中释放。

• 乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯（ETPTA）半球：这个半球赋予了微粒良好的磁性，使其能够在外部磁场的作用下被操纵和移动。这主要源于该半球中包裹的磁性纳米颗粒（Fe₃O₄NPs），这些磁性纳米颗粒使得Janus微粒具备磁性特性，便于通过磁力回收和重复使用。

这种结构设计使得Janus微粒在生物修复应用中具有独特的优势：一方面，活性益生菌S. boulardii可以在PEGDA半球中进行生物转化和重金属离子的吸附；另一方面，ETPTA半球的磁性特性使得微粒可以方便地从废水中回收，实现循环利用。这种设计提高了微粒的环境适应性和操作便利性，对于提高生物修复效率和降低成本具有重要意义。

活性益生菌Janus微粒通过以下机制有效去除废水中的铜离子（Cu²⁺）：

1、吸附作用：Janus微粒中的活性益生菌S. boulardii具有吸附铜离子的能力。S. boulardii细胞表面的官能团（如羧基、氨基、羟基和硫酸基）可以与铜离子形成络合物，从而实现铜离子的吸附。

2、生物转化：S. boulardii通过其代谢活动，将铜离子转化为较低毒性或者更易于处理的形式。这一过程涉及到铜/锌超氧化物歧化酶（SOD1）等酶的催化作用，促进铜离子的生物转化。

3、细胞内部积累：S. boulardii能够将铜离子吸收到细胞内部，通过细胞内的生物化学反应将铜离子转化为细胞可耐受的形式，从而减少外界环境中的铜离子浓度。

图1.（A）流动聚焦微流体装置中Janus微粒的生成示意图。（B）微流控芯片的图片，标明了通道的宽度。（C）当ETPTA和PEGDA之间的流速比为3:1和3:2时，微流体通道中会产生Janus液滴。（D）当ETPTA和PEGDA之间的流速比为3:1、3:2和1:3时，Janus微粒的亮场和荧光图像。ETPTA发出绿色荧光，而包封在PEGDA中的罗丹明B发出红色荧光。（E）不同分散相流速下产生的Janus微粒的尺寸分布。

图2.（A）PEGDA和ETPTA对布拉氏酵母菌的生物相容性。用H₂O₂（10mM）、PEGDA和ETPTA培养24小时后，用钙黄绿素AM/PI对布拉氏酵母菌进行染色。BF（亮场）、钙黄绿素AM（活细胞）和PI（死细胞）。不同条件下培养的布拉氏酵母菌的存活率（B）和细胞活性（C）。（D）RFP标记布拉氏酵母菌的结构和光学图像。pSP-G1-RFP质粒转化布拉氏酵母菌后，在不含Uri的YPD培养基中培养细胞。（E）Fe₃O₄纳米粒子和布拉氏酵母菌功能化Janus微粒的制备过程示意图。（F）活性益生菌包裹磁性Janus微粒的光学图像。RFP标记的布拉氏酵母菌在Fe₃O₄纳米粒子功能化的Janus微粒中的荧光图片（G）和示意图（H）。使用荧光显微镜观察布拉氏酵母菌。（I）磁性表征。通过外部磁体收集由Fe₃O₄ NPs和布拉氏酵母菌功能化的Janus微粒。根据不同的p值定义统计显著性：*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001，ns：两组数据之间的比较没有统计学意义。

图3.不同组分（PEGDA、PEGDA+布拉氏酵母菌、ETPTA和ETPTA+Fe₃O₄）在无菌水中浸泡不同时间后的照片（A）和溶胀比（B）。（C）PEGDA+S. boulardii水凝胶在PBS缓冲液中浸泡不同时间后的图像。（D）布拉氏酵母菌菌落在YPD培养基上的照片，该培养基来源于不同时间的PEGDA+布拉氏酵母菌浸泡溶液。采用多功能酶联免疫吸附测定仪测定布拉氏酵母菌的存活率（E）和细胞活性（F）。（G）使用万能试验机进行压缩强度测试的示意图。PEGDA+S.boulardii和ETPTA+Fe₃O₄的位移时间曲线（H）和载荷时间曲线（I）。（J）PEGDA+S.boulardii和ETPTA+Fe₃O₄的生物相容性试验。L929细胞用PEGDA+S.boulardii和ETPTA+Fe₃O₄浸提液培养2小时后，用钙黄绿素AM/PI试剂盒染色。钙黄绿素-AM（活细胞），PI（死细胞）。比例尺=50μm。（K）L929细胞的存活率。根据不同的p值定义统计显著性：*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001，ns：两组数据之间的比较没有统计学意义。

图4.（A）游离布拉氏酵母菌和包封在Janus微粒中的布拉氏酵母菌的PI阳性细胞。将布拉氏酵母菌和布拉氏酵母菌微粒与Cu²⁺（80mg/L）一起培养不同时间，然后用PI染色。布拉氏酵母菌和包封在Janus微粒中的布拉氏酵母菌在用Cu²⁺（80mg/L）培养后的存活率（B）、细胞活性（C）和TEM图像（D）。比例尺=50μm。根据不同的p值定义统计显著性：*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001，ns：两组数据之间的比较没有统计学意义。

图5.（A）ICP-MS检测的预处理和分析过程示意图。（B）不同组别（布拉氏酵母菌、Janus微粒和布拉氏酵母菌Janus微粒）初始溶液中的残留铜含量。（C）游离布拉氏酵母菌和包裹在Janus颗粒中的布拉氏酵母菌细胞内铜含量的直方图。（D）布拉氏酵母菌的EDS。将布拉氏酵母菌微粒与Cu²⁺溶液培养1天和5天后，通过EDS对布拉氏酵母菌进行分析。（E）与布拉氏酵母菌微球孵育不同时间后，对Cu²⁺溶液进行细胞毒性试验。钙黄绿素AM/PI染色后，通过荧光显微镜观察PI阳性细胞。比例尺=50μm。（F）L929细胞在不同条件下的细胞活性。（G）Fe₃O₄ NPs和布拉氏酵母菌功能化的Janus微粒用于去除Cu²⁺的示意图。根据不同的p值定义统计显著性：*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001，ns：两组数据之间的比较没有统计学意义。

图6.（A）差异基因表达的转录组学分析。将布拉氏酵母菌微粒与Cu²⁺一起培养后，通过RNA-seq检测布拉氏酵母菌的基因表达。（B）差异基因表达的基因热图和（C）基因本体（GO）富集分析。（D,E和F）使用ACT1作为标准化基因通过RT-PCR分析Janus微粒中布拉氏酵母菌的基因表达水平。（G）SOD1-GFP的蛋白质印迹分析。布拉氏酵母菌微粒（SOD1-GFP-URA3）与Cu²⁺培养1、3和5天后，使用抗GFP进行蛋白质印迹分析以检测SOD1-GFP。使用抗微管蛋白抗体作为对照。（H）SOD1-GFP的图像灰度值分析。（I）布拉氏酵母菌微粒去除Cu²⁺的示意图。根据不同的p值定义统计显著性：*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.157855