尽管微流体混合在RNA负载脂质纳米颗粒（RNA-LNP）生产中相较于传统方法具有精确的尺寸控制、均匀分布和高封装效率等优势，但其商业化应用仍面临挑战，尤其是设备表面在长时间操作中容易发生污垢积累，影响性能和可靠性。
为了应对这一挑战，有研究人员提出使用全氟十氢萘（PFD）的固定化液体润滑涂层来创建一个可以排斥多种LNP成分的防污表面，以解决微流控芯片在RNA-LNP生产过程中的表面污染问题。相关研究以“Robust, Scalable Microfluidic Manufacturing of RNA–Lipid Nanoparticles Using Immobilized Antifouling Lubricant Coating”为题目，发表在期刊《ACS Nano》上。
本文要点：
1、使用固定化全氟十氢萘（PFD）润滑层形成防污表面，并将其应用于交错人字形微流控混合芯片（SHM），实现了超过3小时的稳定运行，相比传统方法性能提升15倍。
2、该技术在包含256个SHM混合器的并行化平台上表现出良好的扩展性，支持商业化生产速率。
3、实验验证表明，该方法生产的LNP在理化性质及体内外性能上与未涂层芯片一致。
4、通过抑制表面结垢，该技术显著提升了RNA-LNP生产的可靠性和稳定性，为多种材料的微流控制造提供了新思路。
使用微流控技术生产RNA-LNP相比传统的批量生产方法，具有以下优势：
1、精确控制：微流控技术能够更精确地控制RNA-LNP的颗粒尺寸、形态和封装效率，确保产品的一致性和可重复性。
2、均匀分布：微流控混合能够在微米尺度上实现快速混合，避免了传统批量混合中常见的混合不均匀性，从而提高了封装效率和降低了颗粒的多分散性。
3、高效生产：微流控设备支持并行化设计，能够在单个芯片上集成多个混合单元，从而实现高通量生产，适合商业化应用。
4、减少表面污染：通过使用固定化的液体润滑层（如全氟十氢萘），微流控设备能够有效抑制表面污染，延长设备的稳定运行时间，提升生产的可靠性。
5、适应性强：微流控技术能够适应多种溶剂和复杂的反应环境，适合用于RNA-LNP的生产，而传统方法在这方面的适应性较差。
6、符合制药标准：微流控芯片通常采用硅和玻璃材料，具有良好的溶剂兼容性和高压操作能力，符合制药工业的严格要求。
综上所述，微流控技术在RNA-LNP生产中提供了更高的精度、效率和可靠性，推动了RNA基药物和疫苗的开发与应用。
固定化液体润滑层如何解决微流控设备的结垢问题？
1、形成稳定的防污表面：固定化液体润滑层（如全氟十氢萘）通过与全氟化基底结合，形成一层稳定的液体薄膜，具有疏水性和疏油性，能够排斥RNA-LNP的多种成分。
2、减少颗粒沉积：润滑层的光滑特性使颗粒难以附着在设备表面，从而显著降低结垢风险。
3、延长设备运行时间：实验表明，未涂层芯片在10分钟内会发生结垢，而使用润滑层的芯片可稳定运行超过3小时，性能提升超过15倍。
4、保持产品质量：润滑层能够防止通道堵塞，确保RNA-LNP的粒径均匀性和封装效率，维持高质量生产。
固定化液体润滑层相比传统防污涂层有哪些优势？
1、适应复杂环境：传统涂层（如PEG、两性离子涂层等）主要用于水相环境，而固定化液体润滑层在水/乙醇混合溶剂环境中仍能保持稳定。
2、防污效果更持久：传统涂层在RNA-LNP生产中通常在20分钟内失效，而润滑层可稳定运行超过3小时。
3、减少设备清洗需求：润滑层显著降低了表面污染，减少了清洗频率，提高了生产效率。
4、易于集成：润滑层技术可与硅/玻璃基底兼容，适合制药工业的高压操作和溶剂环境。
图1.（A）使用SCALAR-AF芯片进行RNA-LNP稳健制造的示意图。（B）带有交错人字形微混合器的SCALAR-AF芯片照片。比例尺：10 mm。（C）RNA-LNP在涂有润滑层表面上的抗污行为示意图，显示固定的全氟碳（TP）与基底结合，从而使液态全氟十氢萘（LP）形成稳定的薄膜并附着在表面上。（D）照片展示了水/乙醇（3:1）混合溶液与润滑油相之间的不相容性。（E）绘制了不同表面处理的微流控混合芯片的最大操作时间的图表。（F）示意图和显微镜图像显示抗污微流控芯片能够生产更小且更均一的LNP，用于高效的RNA递送，而批量制备和传统微流控芯片生产的LNP更大且不均一，因设备内部结垢导致RNA递送不精确且不可靠。比例尺：300 μm。冷冻电镜（cryo-TEM）图像显示了通过批量制备、裸芯片和涂有润滑层的芯片在污垢形成前后生产的RNA-LNP。比例尺：100 nm。
图2.（A）展示了在微流控芯片中测试的各种表面涂层方法的示意图，包括裸芯片、PEG、两性离子、层层自组装（LbL）和氟涂层。（B）显示了在45度倾斜角下，水/乙醇（3:1）混合溶液在不同涂层的Si和玻璃基材上的润湿/不润湿情况的照片。（C）左侧列出照片，右侧为动态光散射（DLS）结果，展示了不同芯片在操作时间内的污垢行为和LNP尺寸变化。
图3.（A）由TLP涂层SCALAR-AF芯片生产RNA-LNP的示意图。（B）显示了在45度倾斜角下，水/乙醇混合物在TLP涂层的Si和玻璃基材上的排斥性照片。（C1-C4）显示了在不同高度下，微流控设备表面润滑油层的共聚焦显微镜图像。（D）显微图像揭示了1×SCALAR-AF芯片中优异的混合效率；尼罗红乙醇和FITC水溶液通过通道流动，以量化沿通道不同位置的混合效率。（E）混合效率定量分析（±标准偏差），通过裸芯片和1×SCALAR-AF芯片达到90%混合所需的通道长度计算得出（n=3，单因素方差分析，ns：p>0.05）。（F）连续显微照片显示在约180分钟内进行RNA-LNP配制时未出现严重污染。比例尺：150μm。（G-I）1×SCALAR-AF芯片在1至180分钟内生成的polyA LNPs的物理表征。（G）1至180分钟内生成的polyA LNPs的动态光散射直径（±标准偏差），（H）包封效率（±标准偏差），以及（I）RNA浓度（±标准偏差）（n=3，单因素方差分析，ns：p>0.05）。（J）1×SCALAR-AF芯片生成的polyA LNPs的冷冻电镜（Cryo-TEM）图。比例尺：100 nm和25 nm。
图4.（A）连续显微照片显示在约180分钟内进行两次polyA LNP配制时未出现严重污染。设备经过1%Triton-X100清洗、氮气吹扫，然后进行乙醇清洗，并再次用氮气吹扫。随后，应用全氟十氢萘（PFD）液体形成润滑层以创建防污表面。补充后的SCALAR-AF芯片通过排斥多个LNP成分展现了防污性能。比例尺：150μm。（B-D）两次连续运行中1×SCALAR-AF芯片生成的polyA LNPs的物理表征。（B）1至180分钟内生成的polyA LNPs的动态光散射直径（±标准偏差），（C）包封效率（±标准偏差），和（D）RNA浓度（±标准偏差）（n=3，单因素方差分析，ns：p>0.05）。
图5.（A）256×SCALAR-AF芯片的正面和背面照片。（B）芯片设计的示意图，展示了分支几何结构和梯形设计架构的集成，以确保输入物料在每个混合单元中的均匀分布。该示意图不按比例绘制。（C）输送通道（Rdelivery）、电阻器（Rresistor）、混合通道（Rmixing）以及单个混合通道单元（Rdevice）的电路模型。（D）照片展示了通过定制的压力驱动流系统，利用256×SCALAR-AF芯片扩大RNA-LNP生产规模的实验装置。（E）展示256×SCALAR-AF芯片的组装铝制支架的照片，其正面提供了用于观察不同位置的窗口。（F）拍摄的图像展示了256×和1×SCALAR-AF芯片生产LNPs的相对吞吐量，结果分别为256×芯片在20分钟内生成了4.8L（装在3.5L烧杯中）和1×芯片在10分钟内生成了0.012L（装在15mL Falcon离心管中）。（G）256×SCALAR-AF芯片生成的polyA LNPs的动态光散射直径（±标准偏差），（H）包封效率（±标准偏差），以及（I）RNA浓度测量结果（±标准偏差）（n=3，单因素方差分析，ns：p>0.05）。
图6.（A）示意图展示了裸芯片（在t=1分钟时及严重污染后）和TLP涂层SCALAR-AF芯片（在t=1和60分钟时）生成的荧光素酶RNA-LNPs。（B）使用每种设备生成的荧光素酶RNA-LNPs的DLS结果（动态光散射，±标准偏差）（n=3，单因素方差分析和Tukey多重比较，*p<0.05）。（C）通过RiboGreen检测量化每种设备生成的RNA包封效率（±标准偏差）（n=3，单因素方差分析和Tukey多重比较，*p<0.05）。（D）配制的荧光素酶RNA-LNPs以60 ng/60,000个细胞的剂量施用于HeLa细胞；在6小时后通过发光量化荧光素酶表达水平（n=4-5，单因素方差分析和Tukey多重比较，***p<0.001）。（E）配制的荧光素酶RNA-LNPs以每只鼠4μg的剂量通过尾静脉注射给药。LNP给药后6小时的代表性IVIS成像，显示全身（上图）及解剖器官（下图）的荧光素酶表达。（F）LNP给药后6小时全身荧光素酶信号的量化（n=3-4，单因素方差分析和Tukey多重比较，***p<0.001；****p<0.0001）。（G）肝脏中荧光素酶信号的量化（n=3，单因素方差分析和Tukey多重比较，**p<0.01；***p<0.001）。
论文链接：
https://doi.org/10.1021/acsnano.4c12965
