微流控驱动脂质纳米颗粒创新：开辟蛋白质治疗新篇章-北京永康乐业科技发展有限公司

一、概述

蛋白质药物在现代医学中占据重要地位，但由于蛋白质不能有效地穿过质膜，因此蛋白质治疗药物仅限于细胞表面或血清中的靶标配体。脂质纳米颗粒（LNP）作为一种有效的药物递送载体，已被成功应用于mRNA疫苗（如新冠疫苗）的开发。然而，将蛋白质封装在LNP中并实现高效细胞内递送仍然是一个技术难题。近期，乔治亚大学的Richard B. Meagher等在《Communications Materials》上发表了一项突破性研究，提出了一种利用微流控技术将蛋白质高效封装在LNP中的方法，为蛋白质药物的细胞内递送提供了新的解决方案。

该研究的核心假设是，大多数蛋白质在生理条件下表现为两性离子化多聚阳离子，能够与阴离子脂质结合，从而通过微流控技术实现蛋白质在LNP中的高效封装。研究团队通过一系列实验验证了这一假设，并展示了封装后的蛋白质在细胞内的高效传递和功能保留。

二、实验方法

研究中采用微流控组装技术实现蛋白质的封装。具体而言，研究人员将蛋白质溶解在酸性或中性缓冲液（pH 5.5的乙酸缓冲液或pH 7.0的PBS）中，而脂质溶解于两种不同的有机溶剂混合物中：1#为三氯甲烷（TCM）:乙醇（EtOH）1:1（体积比）；2#为三氟乙醇（TFE）:甲醇（MeOH）4:1（体积比）。封装所使用的脂质混合物以50 mol%的阴离子磷脂DMPG为主，并配以其他辅助脂质，其成分与现代mRNA-LNP疫苗中的脂质类似，但用DMPG替代阳离子脂质SM102。蛋白质与脂质的质量比为1:20，在微流控包装后，立即将LNP通过透析去除有机溶剂并置于中性缓冲液中，从而完成脂质膜的闭合结构，形成稳定的纳米颗粒。

实验测试了分子量从28 kDa到148 kDa、等电点（pI）范围为5.3至8.7的6种不同蛋白质，包括三种荧光蛋白（mCherry、EBFP2、Venus）、牛血清白蛋白（BSA）以及两种单克隆抗体（Trastuzumab和IgG）。封装后，通过多种表征方法验证颗粒的物理化学特性，包括透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）和流式纳米颗粒分析仪（NanoFCM）。此外，通过荧光显微镜和过滤实验，评估蛋白质的封装效率以及未封装蛋白的去除效果。

为验证封装蛋白的细胞内递送性能，实验使用了人肺腺癌细胞（A549）和乳腺癌细胞（SKBR3）。细胞分别与封装蛋白的LNP（EP-LNP）和游离蛋白孵育。荧光显微镜用于观察荧光蛋白在细胞内的分布情况，同时抗体的功能性通过检测HER2受体结合能力得以验证。

三、实验结果

实验结果显示，使用阴离子磷脂DMPG的脂质混合物显著提高了蛋白质的封装效率，封装效率在pH 5.5和7.0条件下普遍达到70%-90%，其中荧光蛋白mCherry在pH 5.5条件下的封装效率最高，可达98.1%。相比之下，当使用阳离子脂质（如SM102）取代DMPG时，封装效率大幅下降，不足1%。同时，实验还表明，所封装的蛋白质在4°C条件下存储数月后，依然能够保持生物活性，例如荧光蛋白的荧光信号强度无显著下降，且封装的Trastuzumab保持了其结合HER2受体的能力。这进一步证实了在有机溶剂TFE:MeOH（4:1）中制备的LNP能够有效避开蛋白的变性问题。

在细胞递送实验中，EP-LNP表现出显著的细胞内递送效率。在A549细胞和SKBR3细胞中，封装蛋白的荧光信号显著强于未封装的游离蛋白，表明LNP能够高效地穿透细胞膜并将蛋白质递送进入胞质。此外，封装的Trastuzumab在HER2高表达的SKBR3细胞中，能够与HER2受体结合且诱导了明显的多泡体表型，显示其在细胞内仍然具有良好的功能性；而在HER2低表达的A549细胞中，无特异性结合，进一步验证了其靶向性。

四、结语

该研究通过微流控技术实现了蛋白质在脂质纳米颗粒中的高效封装，并证明了封装后的蛋白质能够高效进入细胞并保持功能。这一技术突破为蛋白质药物的细胞内递送提供了新的可能性，有望推动蛋白质治疗在癌症、心血管疾病、代谢性疾病等多个领域的应用。未来，研究人员将进一步探索不同阴离子脂质对蛋白质封装效率的影响，并优化LNP的组成和制备条件，以实现更高效的蛋白质药物递送。